實(shí)驗(yàn)概要
本方法主要介紹小鼠胚胎干細(xì)胞體外EB分化鑒定流程。
主要試劑
高糖DMEM(Gibco,cat 2800-017粉末）、DMEM/F12（Gibco,cat 2500-062粉末）、胎牛血清（FBS）（Gibco,cat 6000044）
非必需氨基酸（NEAA） （Gibco,cat 1140050）、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid（Gibco,cat NO：25200072）、明膠（BD,cat NO：354277）、青鏈霉素（SP）（Gibco,cat 5140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO：25030081)、血清替代物（Gibco,cat 0829028）
10%FBS培養(yǎng)液(Gibco , cat 0099141）
主要設(shè)備
1、超凈臺(tái)
2、CO2培養(yǎng)箱(Thermo , cat NO.3131)
3、6cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430166)、10cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430167)
4、15ml離心管(corning , cat NO.430791)、50ml離心管(corning , cat NO.430829)、凍存管(corning , cat NO.430659)
5、正置顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟
①常規(guī)方法消化細(xì)胞，吹打時(shí)用粗口滴管，只吹打成細(xì)胞團(tuán)塊；
②將細(xì)胞團(tuán)塊移至6 cm或10 cm培養(yǎng)皿中，改用含10%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)（每個(gè)6 cm培養(yǎng)皿加5 ml培養(yǎng)液）；
③將培養(yǎng)皿放入37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天取出1－2次，輕輕晃動(dòng)或用粗口滴管吹打，使細(xì)胞懸浮，各團(tuán)分開，并逐日觀察；
④一般培養(yǎng)第3天細(xì)胞團(tuán)開始分層，外部是一層較大的內(nèi)胚層樣細(xì)胞，內(nèi)部的細(xì)胞則小而緊密，為外胚層樣細(xì)胞和干細(xì)胞，此為簡(jiǎn)單類胚；再培養(yǎng)5－10天，分層增多，并出現(xiàn)空腔，整個(gè)胚呈圓泡狀，此為囊狀胚。
⑤收集囊狀胚，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用三胚層的引物進(jìn)行PCR來(lái)檢測(cè)三胚層的基因的表達(dá)情況，從而確定囊狀胚中是否有三胚層的分化，這樣可以確定細(xì)胞是否具有在體外分化為三胚層細(xì)胞的能力。